掃描電鏡在觀察生物樣品微觀結構時具有不可替代的優勢，但生物組織脆弱、含水率高，直接觀察易導致結構塌陷或電荷積累。本文將系統梳理生物樣品SEM掃描電鏡制備的標準化流程，結合前沿技術分享實戰技巧，助您攻克電鏡成像難題。

一、樣品預處理核心步驟

化學固定

醛類固定：2.5%戊二醛+2%多聚甲醛混合液，4℃固定2-4小時（細胞膜保存更優）。

微波輔助：采用梯度升溫法（30℃→50℃→70℃），縮短固定時間至30分鐘。

注意事項：固定液體積需10倍以上樣品體積，避免結構擠壓變形。

清洗與后固定

緩沖液清洗：0.1M磷酸緩沖液（pH7.4）漂洗3次，每次15分鐘。

鋨酸染色：1%鋨酸后固定1小時，增強膜結構對比度（需通風櫥操作）。

二、脫水與干燥技術對比

梯度脫水法

乙醇梯度：30%→50%→70%→90%→****，每步15分鐘（避免細胞驟縮）。

丙酮過渡：Z終脫水劑換為丙酮，減少后續臨界點干燥（CPD）殘留。

臨界點干燥（CPD）

優勢：液態CO?替代乙醇，無表面張力，W美保留三維結構。

操作要點：升溫至37℃后緩慢釋放CO?，壓力控制在72.8 bar以上。

冷凍干燥法

適用場景：含冰晶樣品（如植物組織），需預先液氮速凍。

缺點：冰晶升華易產生孔隙，需結合低溫包埋劑優化。

三、導電鍍膜與電荷消除

金屬鍍膜

鉑/鈀合金：3-5nm厚度，兼顧導電性與二次電子信號（優于純金鍍膜）。

離子濺射儀參數：電流20mA，時間40秒（樣品旋轉臺需開啟）。

碳涂層技術

碳棒蒸發法：形成10-15nm碳膜，適合導電性極差的生物膜樣品。

優勢：避免金屬偽影，提升能譜分析（EDS）精度。

電荷消除劑

導電膠固定：銀膠或碳膠直接粘附樣品，建立導電通路。

離子液體噴涂：新型電荷消散劑（如AFAR試劑）可替代傳統鍍膜。

四、特殊樣品制備技巧

含水樣品處理

低溫包埋：LR White樹脂4℃滲透24小時，紫外聚合固化。

環境掃描電鏡（ESEM）：直接觀察含水樣品，需控制艙內濕度（60%-80%）。

染色增強技術

重金屬染色：1%醋酸鈾負染30秒，突出細胞膜結構。

導電染色劑：磷鎢酸（PTA）染色可同步提升導電性與對比度。

大樣品分割策略

振動切片：使用振動切片機，獲取50-100μm薄片。

激光微切割：結合熒光標記定位目標區域，實現**取樣。

五、常見問題解決方案

樣品充電嚴重

排查路徑：鍍膜厚度不足→增加濺射時間；樣品未完全干燥→延長CPD時間。

結構塌陷

改進方案：固定后增加2%單寧酸后固定步驟；脫水時添加1%Triton X-100表面活性劑。

分辨率不足

優化策略：工作距離調至3-4mm；啟用減速模式（減速比50-100V）。

生物樣品SEM掃描電鏡制備是技術與經驗的結合，從固定劑選擇到鍍膜參數，每個環節都影響*終成像質量。建議建立標準化操作流程（SOP），并通過正交實驗優化關鍵參數。如需應對復雜樣本或提升通量，可考慮自動化制備系統。掌握這些核心技術，您將充分釋放掃描電鏡在生命科學領域的潛能。